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Antikörper - rekombinante Proteine - Färbereagenzien


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Produkte > VECTOR-Reagenzien

Art.-Nr.


PK-6100 : VECTASTAIN Elite ABC Standard Kit - Peroxidase



Preis: 280 € / 1 Kit ca. 1000 Färbungen

Färbekits

Menge:1 Kit ca. 1000 Färbungen
 

Dreifach-Färbung mit Vectastain Elite ABC Kit, Epithelzellen (VECTOR Red), Endothelzellen (Vector Blue) Zellkerne proliferierender Zellen (DAB, Braun)


Allgemeines:Das VECTASTAIN ABC System stellt ein universell einsetzbares Detektionssystem für die Immunologie und Molekularbiologie dar. Die patentierte Technik (US Patent 4,684,609) kann heute als das weitest verbreitete Färbesystem in der Immunhistochemie angesehen werden. Mehr als 8000 wissenschaftliche Publikationen gründen sich auf diese Methode, die von VECTOR Laboratories Inc. Ende der 70er Jahre kommerziell verfügbar gemacht wurde.

Um ein Antigen im Western Blot oder in der Immunhistochemie nachzuweisen, wird nach der Applikation eines biotinylierten Primär- oder Sekundärantikörpers ein vorgeformter Komplex aus Avidin (Streptavidin) und biotinyliertem Enzym eingesetzt.

Die Bindung zwischen Avidin und Biotin ist außerordentlich hoch (Ka >1015/M) und damit um mehrere Zehnerpotenzen höher als die zwischen Antigen und Antikörper (Ka = 107-1011/M). Dies verringert die Gefahr von Auswaschungen während der verschiedenen Färbeschritte, wie sie noch bei PAP oder APAAP-Methoden gegeben ist.

Die Bildung eines optimierten Komplexes zwischen Avidin und Enzym schließt eine außerordentlich hohe Signalverstärkung ein, so daß auch Antigene in sehr kleinen Mengen oder Konzentrationen nachgewiesen werden können (pg- und fg-Bereich).

Bindeglied zwischen Antigen-spezifischem Primärantikörper und dem Avidin-Biotin-Enzymkomplex stellen affinitätsgereinigte biotinylierte Sekundärantikörper dar, die gegen die artspezifischen Immunglobulinketten des Primärantikörpers gerichtet sind. Durch Austausch des Sekundärantikörpers oder durch die Verwendung eines Universalantikörpers kann das System universell eingesetzt werden.

Die ABC-Technik erlaubt es, zwei oder mehr Antigene in demselben Gewebe nachzuweisen - auch wenn die Primärantikörper aus derselben Tierart stammen (siehe Abbildung).

VECTASTAIN ABC Kits sind mit 3 verschiedenen
Enzymkonjugaten erhältlich:

1. VECTASTAIN ABC Kit - Peroxidase

2. VECTASTAIN Elite ABC Kit - Peroxidase

3. VECTASTAIN ABC AP Kit - Alkalische Phosphatase

4. VECTASTAIN ABC GO Kit - Glukoseoxidase

Für jedes Enzym stehen separate Kits mit unterschiedlich farbigen Substraten zur Verfügung:

1. Peroxidase: Braun (DAB), Orange-Rot (AEC), Ziegelrot (NovaRed), Blau (TMB), Blaugrau (VECTOR® SG), Violett (VECTOR® VIP), Grün (ABTS für ELISA) und Blaugrau (4-CN für Western Blot)

2. Alkalische Phosphatase: Rot (VECTOR® Red), Blau (VECTOR® Blue oder BCIP/NBT), Schwarz (VECTOR® Black) und Gelb (pNPP für ELISA)

3. Glukoseoxidase: Blau/Violett (NBT), Schwarz (TNBT) und Rot (INT)

VECTASTAIN ABC Kits enthalten im Normalformat Blockierungsserum, Sekundärantikörper, Avidin und biotinyliertes Enzym. Die sog. Standard-Kits enthalten nur Avidin (Komponente A) und biotinyliertes Enzym (Komponente B), was von besonderem Interesse für die Verwendung in der Molekularbiologie zur Detektion von biotinylierter DNA und RNA ist.
 
Inhalt
VECTASTAIN Elite ABC Kit - Peroxidase
ausreichend für 1000 immunhistochemische Färbungen oder 50 Transfer-Blots (100 qcm)

Reagenz A (Avidin-Lösung) (grau):2 ml

Reagenz B (biotinyliertes Enzym) (grau):2 ml


Alle Reagenzien in Tropfflasche,
Standard-Kits (Art.-Nr. PK-6100) enthalten nur Reagenz A und B;
Normalserum und Sekundärantikörper sind separat erhältlich und in den Tierart-spezifischen Kits (PK-6101 bis PK-6106)enthalten.
 
Zusätzlich benötigte Reagenzien
Primärantikörper, Puffer, Wasserstoffperoxid zum Blockieren endogener Enzyme, Blockierungsserum (entspechend dem Sekundärantikörper auswählen Art.-Nr. S-1000 bis S-5000), biotinylierter Sekundärantikörper (Art.-Nr. BA-1000 bis BA-9500)
Chromogen/Substrat nach Wahl
 
Puffer
PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,01M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH 7.2 - 7.5) oder
Tris-HCl-Puffer (0,1 M Tris-Hydoxymethyl-Aminomethan, HCl, 0,15 M NaCl, pH 7.5)
 
Normalserum (nicht im Kit enthalten)
10 ml Puffer in gelb markierte Mischflasche vorlegen.
Zugabe von 3 Tropfen Normalserum aus kleiner gelb markierter Tropfflasche.
Mischen
 
Biotinylierter Sekundärantikö:rper
10 ml Puffer in blau markierte Mischflasche vorlegen
(Optional: Zugabe von 3 Tropfen Normalserum aus kleiner gelb markierter Tropfflasche).
Zugabe von 1 Tropfen biotinyliertem Antikörper aus kleiner blau markierter Tropfflasche.
Mischen
 
Avidin-Biotin-Enzym-Komplex
5 ml Puffer in Mischflasche vorlegen.
Zugabe von je 2 Tropfen Reagenz A und B aus kleinen grau markierten Tropfflaschen.
Mischen.
Vor Gebrauch 30 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.
Diese Lösung ist bei 2 - 8 °C max. 3 Tage haltbar.

Bei geringerem Bedarf können auch kleinere Lösungsmengen angesetzt werden, wobei 1 Tropfen mit 50 µl zu berechnen ist.
 
Färbeanleitung Elite HRPO
1. Gewebeschnitte entparaffinieren (falls erforderlich) über Xylolersatz, Ethanol, Ethanol 70 %, aqua demin.

2. Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit 1 % Wasserstoffperoxid in PBS, 30 min (bei blutreichem Gewebe 1 % Wasserstoffperoxid in Methanol verwenden).

3. Demaskierung der Formaldehyd-fixierten Schnitte mit Demaskierungslösung C (Art.-Nr. DE000), oder Demaskierungslösung G (Art.-Nr. DE007), Demaskierungslösung H (Art.-Nr. DE008) oder Demaskierungslösung P - Pronase (Art.-Nr. DE110).

4. Spülen mit PBS.

5. Blockieren der unspezifischen Proteinbindung mit verdünntem Normalserum (gelbes Fläschchen) Inkubation 20 min bei RT oder 10 min bei 37°C.

6. Überschüssiges Normalserum absaugen (evtl. endogenes Biotin blockieren mit Avidin/Biotin-Blockierungskit Art.-Nr. SP-2001).

7. Auftropfen des Primärantikörpers (durchschnittliche Inkubationszeit 60 min bei RT).

8. Zweimaliges Spülen mit PBS.

9. Auftropfen des vorverdünnten, biotinylierten Sekundärantikörpers (blaues Fläschchen) Inkubation 30 min bei RT oder 15 min bei 37°C.

10. ABC-HRPO-Reagenz ansetzen 30 min vor Gebrauch in Mischflasche mischen und bei RT stehen lassen.

11. Zweimaliges Spülen mit PBS.

12. Auftropfen des ABC-HRPO-Komplexes, Inkubation 30 min bei RT oder 15 min bei 37°C.

13. Dreimal spülen mit PBS (ohne Konservierungsmittel Na-Azid!)

14. Inkubation mit Peroxidasesubstrat/Chromogengemisch

3-5 min DAB* (10-30 min AEC** oder 5-15 min VECTOR-SG, VECTOR-VIP und VECTOR NovaRed™).

15. Spülen mit Wasser 5 min.

16. Kern-Gegenfärbung mit Hämatoxylin (Art.-Nr. H-3401), Methylgrün (Art.-Nr. H3402) oder Nuclear Fast Red (Art.-Nr. 3403) abhängig vom verwendeten Substrat.

17. Wässern, (Entwässern), Eindecken --- Achtung: AEC-gefärbte Schnitte wässrig eindecken!

 
* Art.-Nr. DA002 Peroxidase Färbekit DAB (Braun)

**Art.-Nr. AE002 Peroxidase Färbekit AEC (Rot)

 



Hinweise
1. Die Schnittdicke beträgt für eine gute Darstellung der Zellen nicht mehr als 5µm.

2. Die Schnitte werden auf Adhäsionsobjektträger (z.B. silanisierte Objektträger Art.-Nr. ZU002 oder VECTABOND-beschichtete Objektträger Art.-Nr. SP-1800) aufgezogen und min. 1 h bei 37°C getrocknet.

3. Nach dem Entparaffinieren und bei keinem der Färbeschritte dürfen die Schnitte aus- oder antrocknen. Bei längeren Inkubationszeiten erfolgt dies in einer feuchten Kammer.

4. Die Reagenzien-Konzentrationen sind zu optimieren. Häufig besteht Unklarheit über die richtige Konzentration des Primärantikörpers. Bei Hintergrundreaktionen hilft oft eine Verdünnung des Primärantikörpers.

5. Letzteres gilt insbesondere bei Verwendung des VECTASTAIN ABC Systems, das viel empfindlicher ist als viele andere Nachweissysteme (Kostenersparnis durch Verdünnung der Primärantikörper).

6. Bei der Verdünnung von Antikörpern müssen Konservierungsmittel und stabilisierende Proteine zugesetzt werden, z.B. kristallines, biotinfreies BSA.

7. Bei hoher Antigen-Konzentration kann die Inkubationszeit verkürzt werden.

8. Bei niedriger Antigen-Konzentration ergibt sich eine verlängerte Inkubationszeit; u.U. ist eine Inkubation bei 4°C über Nacht zu empfehlen.

9. Bakterielle Kontamination der Lösungen vermeiden!

10. Puffer zum Ansetzen des ABC-Reagenzes und der Substrate dürfen keine Konservierungsmittel und keine Proteine oder Serum enthalten!

11. Für die AP-Substrate ist ein Tris-Puffer (pH 8,5 - 9,5) zu empfehlen, PBS sollte hier vermieden werden!

12. Pufferlösungen in doppelt destilliertem Wasser ansetzen

13. Reagenzien immer bei 2 - 8°C aufbewahren, Antikörper ohne Konservierungsmittel sind portioniert bei -20°C zu lagern.

14. Beachten Sie das Verfallsdatum von Reagenzien. Bei Verwendung der Tropfflaschen und gekühlter Lagerung sind VECTASTAIN ABC Reagenzien min. ein Jahr haltbar.

15. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Primärantikörper ist zu vermeiden. VECTASTAIN ABC Reagenzien werden bei 2 - 8°C gelagert. Tiefgekühlte Lagerung ist nicht vorteilhaft!




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