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PK-7200: VECTASTAIN Elite ABC Universal R.T.U. Kit - Peroxidase

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Preis: 260 € / 1 Kit ca. 500 Färbungen

Färbekits

Menge:	1 Kit ca. 500 Färbungen

Inhalt VECTASTAIN Elite ABC Universal R.T.U. Kit - Peroxidase ausreichend für 500 immunhistochemische Färbungen oder 25 Transfer-Blots (100 qcm) 50 ml Normalserum (gelb) gebrauchsfertig 50 ml biotinylierter Sekundärantikörper Pferd-anti-Maus/Kaninchen IgG (blau) 50 ml Avidin/Biotin/Peroxidase-Komplex)(grau)

Zusätzlich benötigte Reagenzien Primärantikörper, Puffer, Wasserstoffperoxid zum Blockieren endogener Enzyme, Chromogen/Substrat nach Wahl

Puffer (nicht im Kit enthalten) PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,01M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH 7.2 - 7.5) oder Tris-HCl-Puffer (0,1 M Tris-Hydoxymethyl-Aminomethan, HCl, 0,15 M NaCl, pH 7.5)



Färbeanleitung Elite HRPO 1. Gewebeschnitte entparaffinieren (falls erforderlich) über Xylolersatz, Ethanol, Ethanol 70 %, aqua demin. 2. Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit 1 % Wasserstoffperoxid in PBS, 30 min (bei blutreichem Gewebe 1 % Wasserstoffperoxid in Methanol verwenden). 3. Demaskierung der Formaldehyd-fixierten Schnitte mit Demaskierungslösung C (Art.-Nr. DE000), oder Demaskierungslösung G (Art.-Nr. DE007), Demaskierungslösung E (Art.-Nr. DE006) oder Demaskierungslösung P - Pronase (Art.-Nr. DE110). 4. Spülen mit PBS. 5. Blockieren der unspezifischen Proteinbindung mit verdünntem Normalserum (gelbes Fläschchen) Inkubation 20 min bei RT oder 10 min bei 37°C. 6. Überschüssiges Normalserum absaugen (evtl. endogenes Biotin blockieren mit Avidin/Biotin-Blockierungskit Art.-Nr. SP-2001). 7. Auftropfen des Primärantikörpers (durchschnittliche Inkubationszeit 60 min bei RT). 8. Zweimaliges Spülen mit PBS. 9. Auftropfen des gebrauchsfertigen biotinylierten Sekundärantikörpers (blaues Fläschchen) Inkubation 30 min bei RT oder 15 min bei 37°C. 10. Zweimaliges Spülen mit PBS. 11. Auftropfen des ABC-HRPO-Komplexes, Inkubation 30 min bei RT oder 15 min bei 37°C. 12. Dreimal spülen mit PBS (ohne Konservierungsmittel Na-Azid!) 13. Inkubation mit Peroxidasesubstrat/Chromogengemisch 3-5 min DAB* (10-30 min AEC** oder 5-15 min VECTOR-SG, VECTOR-VIP und VECTOR NovaRed™). 14. Spülen mit Wasser 5 min. 15. Kern-Gegenfärbung mit Hämatoxylin (Art.-Nr. H-3401), Methylgrün (Art.-Nr. H-3402) oder Nuclear Fast Red (Art.-Nr.H-3403) abhängig vom verwendeten Substrat. 16. Wässern, (Entwässern), Eindecken --- Achtung: AEC-gefärbte Schnitte wässrig eindecken!

* Art.-Nr. DA002 Peroxidase Färbekit DAB (Braun) **Art.-Nr. AE002 Peroxidase Färbekit AEC (Rot)

Hinweise
1. Die Schnittdicke beträgt für eine gute Darstellung der Zellen nicht mehr als 5µm.

2. Die Schnitte werden auf Adhäsionsobjektträger (z.B. silanisierte Objektträger Art.-Nr. ZU002 oder VECTABOND-beschichtete Objektträger Art.-Nr. SP-1800) aufgezogen und min. 1 h bei 37°C getrocknet.

3. Nach dem Entparaffinieren und bei keinem der Färbeschritte dürfen die Schnitte aus- oder antrocknen. Bei längeren Inkubationszeiten erfolgt dies in einer feuchten Kammer.

4. Die Reagenzien-Konzentrationen sind zu optimieren. Häufig besteht Unklarheit über die richtige Konzentration des Primärantikörpers. Bei Hintergrundreaktionen hilft oft eine Verdünnung des Primärantikörpers.

5. Letzteres gilt insbesondere bei Verwendung des VECTASTAIN ABC Systems, das viel empfindlicher ist als viele andere Nachweissysteme (Kostenersparnis durch Verdünnung der Primärantikörper).

6. Bei der Verdünnung von Antikörpern müssen Konservierungsmittel und stabilisierende Proteine zugesetzt werden, z.B. kristallines, biotinfreies BSA.

7. Bei hoher Antigen-Konzentration kann die Inkubationszeit verkürzt werden.

8. Bei niedriger Antigen-Konzentration ergibt sich eine verlängerte Inkubationszeit; u.U. ist eine Inkubation bei 4°C über Nacht zu empfehlen.

9. Bakterielle Kontamination der Lösungen vermeiden!

10. Puffer zum Ansetzen des ABC-Reagenzes und der Substrate dürfen keine Konservierungsmittel und keine Proteine oder Serum enthalten!

11. Für die AP-Substrate ist ein Tris-Puffer (pH 8,5 - 9,5) zu empfehlen, PBS sollte hier vermieden werden!

12. Pufferlösungen in doppelt destilliertem Wasser ansetzen

13. Reagenzien immer bei 2 - 8°C aufbewahren, Antikörper ohne Konservierungsmittel sind portioniert bei -20°C zu lagern.

14. Beachten Sie das Verfallsdatum von Reagenzien. Bei Verwendung der Tropfflaschen und gekühlter Lagerung sind VECTASTAIN ABC Reagenzien min. ein Jahr haltbar.

15. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Primärantikörper ist zu vermeiden. VECTASTAIN ABC Reagenzien werden bei 2 - 8°C gelagert. Tiefgekühlte Lagerung ist nicht vorteilhaft!