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AK-5000 bis AK-5010: VECTASTAIN ABC AP Kit - Alkalische Phosphatase

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Färbekits

Menge:	1 Kit ca. 2000 Färbungen

Allgemeines:	Das VECTASTAIN ABC System stellt ein universell einsetzbares Detektionssystem für die Immunologie und Molekularbiologie dar. Die patentierte Technik (US Patent 4,684,609) kann heute als das weitest verbreitete Färbesystem in der Immunhistochemie angesehen werden. Mehr als 8000 wissenschaftliche Publikationen gründen sich auf diese Methode, die von VECTOR Laboratories Inc. Ende der 70er Jahre kommerziell verfügbar gemacht wurde. Um ein Antigen im Western Blot oder in der Immunhistochemie nachzuweisen, wird nach der Applikation eines biotinylierten Primär- oder Sekundärantikörpers ein vorgeformter Komplex aus Avidin (Streptavidin) und biotinyliertem Enzym eingesetzt. Die Bindung zwischen Avidin und Biotin ist außerordentlich hoch (K_a >10¹⁵/M) und damit um mehrere Zehnerpotenzen höher als die zwischen Antigen und Antikörper (K_a = 10⁷-10¹¹/M). Dies verringert die Gefahr von Auswaschungen während der verschiedenen Färbeschritte, wie sie noch bei PAP oder APAAP-Methoden gegeben ist. Die Bildung eines optimierten Komplexes zwischen Avidin und Enzym schließt eine außerordentlich hohe Signalverstärkung ein, so daß auch Antigene in sehr kleinen Mengen oder Konzentrationen nachgewiesen werden können (pg- und fg-Bereich). Bindeglied zwischen Antigen-spezifischem Primärantikörper und dem Avidin-Biotin-Enzymkomplex stellen affinitätsgereinigte biotinylierte Sekundärantikörper dar, die gegen die artspezifischen Immunglobulinketten des Primärantikörpers gerichtet sind. Durch Austausch des Sekundärantikörpers oder durch die Verwendung eines Universalantikörpers kann das System universell eingesetzt werden. Die ABC-Technik erlaubt es, zwei oder mehr Antigene in demselben Gewebe nachzuweisen - auch wenn die Primärantikörper aus derselben Tierart stammen (siehe Abbildung). VECTASTAIN ABC Kits sind mit 3 verschiedenen Enzymkonjugaten erhältlich: 1. VECTASTAIN ABC Kit - Peroxidase 2. VECTASTAIN Elite ABC Kit - Peroxidase 3. VECTASTAIN ABC AP Kit - Alkalische Phosphatase 4. VECTASTAIN ABC GO Kit - Glukoseoxidase Für jedes Enzym stehen separate Kits mit unterschiedlich farbigen Substraten zur Verfügung: 1. Peroxidase: Braun (DAB), Orange-Rot (AEC), Ziegelrot (NovaRed^™), Blau (TMB), Blaugrau (VECTOR^® SG), Violett (VECTOR^® VIP), Grün (ABTS für ELISA) und Blaugrau (4-CN für Western Blot) 2. Alkalische Phosphatase: Rot (VECTOR^® Red), Blau (VECTOR^® Blue oder BCIP/NBT), Schwarz (VECTOR^® Black) und Gelb (pNPP für ELISA) 3. Glukoseoxidase: Blau/Violett (NBT), Schwarz (TNBT) und Rot (INT) VECTASTAIN ABC Kits enthalten im Normalformat Blockierungsserum, Sekundärantikörper, Avidin und biotinyliertes Enzym. Die sog. Standard-Kits enthalten nur Avidin (Komponente A) und biotinyliertes Enzym (Komponente B), was von besonderem Interesse für die Verwendung in der Molekularbiologie zur Detektion von biotinylierter DNA und RNA ist.

Inhalt VECTASTAIN ABC AP Kit - Alk. Phosphatase ausreichend für min. 2000 immunhistochemische Färbungen oder 50 Transfer-Blots (100 qcm) Normalserum (gelb): 3 ml Biotinylierter Sekundärantikörper (blau):1 ml Reagenz A (Avidin-Lösung) (rot):2 ml Reagenz B (biotinylierte Alkalische Phosphatase) (rot): 2 ml Alle Reagenzien in Tropfflasche, Standard-Kits (Art.-Nr. AK-5000) enthalten nur Reagenz A und B; Normalserum und Sekundärantikörper sind separat erhältlich.

Zusätzlich benötigte Reagenzien Primärantikörper, Puffer, Levamisol (Art.-Nr. SP-5000) zum Blockieren endogener Alkalischer Phosphatasen, Chromogen/Substrat nach Wahl

Puffer Tris-HCl-Puffer (0,1 M Tris-Hydoxymethyl-Aminomethan, HCl, 0,15 M NaCl, pH 7.5)

Normalserum 10 ml Puffer in gelb markierte Mischflasche vorlegen. Zugabe von 3 Tropfen Normalserum aus kleiner gelb markierter Tropfflasche. Mischen

Biotinylierter Sekundärantikö:rper 10 ml Puffer in blau markierte Mischflasche vorlegen. Zugabe von 1 Tropfen biotinyliertem Antikörper aus kleiner blau markierter Tropfflasche. Mischen.

Avidin-Biotin-Enzym-Komplex 10 ml Puffer in Mischflasche vorlegen. Zugabe von je 2 Tropfen Reagenz A und B aus kleinen rot markierten Tropfflaschen. Mischen. Vor Gebrauch 30 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen. Diese Lösung ist bei 2 - 8 °C max. 3 Tage haltbar. Bei geringerem Bedarf können auch kleinere Lösungsmengen angesetzt werden, wobei 1 Tropfen mit 50 µl zu berechnen ist.

Färbeanleitung ABC AP 1. Gewebeschnitte entparaffinieren (falls erforderlich) über Xylolersatz, Ethanol, Ethanol 70 %, aqua demin. 2. Demaskierung der Formaldehyd-fixierten Schnitte mit Demaskierungslösung C (Art.-Nr. DE000), oder Demaskierungslösung G (Art.-Nr. DE007), Demaskierungslösung H (Art.-Nr. DE008) oder Demaskierungslösung P - Pronase (Art.-Nr. DE110). 3. Spülen mit TBS. 4. Blockieren der unspezifischen Proteinbindung mit verdünntem Normalserum (gelbes Fläschchen) Inkubation 20 min bei RT 5. Überschüssiges Normalserum absaugen (evtl. endogenes Biotin blockieren mit Avidin/Biotin-Blockierungskit Art.-Nr. SP-2001). 6. Auftropfen des Primärantikörpers (durchschnittliche Inkubationszeit 60 min bei RT). 7. Zweimaliges Spülen mit TBS. 8. Auftropfen des vorverdünnten, biotinylierten Sekundärantikörpers (blaues Fläschchen) Inkubation 30 min bei RT. 9. ABC-AP-Reagenz ansetzen 30 min vor Gebrauch in Mischflasche mischen und bei RT stehen lassen. 10. Zweimaliges Spülen mit TBS. 11. Auftropfen des ABC-AP-Komplexes, Inkubation 30 min bei RT. 12. Dreimal spülen mit TBS 13. Inkubation mit AP-Substrat* 20 - 30 min (VECTOR Red Art.-Nr. SK-5100, VECTOR Blue Art.-Nr. SK-5300 oder Fast Red™ BIOLOGO Art.-Nr. AP001). 14. Spülen mit Wasser. 15. Kern-Gegenfärbung mit Hämatoxylin (Art.-Nr. H-3401), Methylgrün (Art.-Nr. H-3402) oder Nuclear Fast Red (Art.-Nr. H-3403) abhängig vom verwendeten Substrat. 16. Wässern, (Entwässern), Eindecken --- Achtung: Einige AP-Reaktionsprodukte müssen wässrig eingedeckt werden (z.B. FastRed, Neu-Fuchsin)!

Hinweise
1. Die Schnittdicke beträgt für eine gute Darstellung der Zellen nicht mehr als 5µm.

2. Die Schnitte werden auf Adhäsionsobjektträger (z.B. silanisierte Objektträger Art.-Nr. ZU002 oder VECTABOND-beschichtete Objektträger Art.-Nr. SP-1800) aufgezogen und min. 1 h bei 37°C getrocknet.

3. Nach dem Entparaffinieren und bei keinem der Färbeschritte dürfen die Schnitte aus- oder antrocknen. Bei längeren Inkubationszeiten erfolgt dies in einer feuchten Kammer.

4. Die Reagenzien-Konzentrationen sind zu optimieren. Häufig besteht Unklarheit über die richtige Konzentration des Primärantikörpers. Bei Hintergrundreaktionen hilft oft eine Verdünnung des Primärantikörpers.

5. Letzteres gilt insbesondere bei Verwendung des VECTASTAIN ABC Systems, das viel empfindlicher ist als viele andere Nachweissysteme (Kostenersparnis durch Verdünnung der Primärantikörper).

6. Bei der Verdünnung von Antikörpern müssen Konservierungsmittel und stabilisierende Proteine zugesetzt werden, z.B. kristallines, biotinfreies BSA.

7. Bei hoher Antigen-Konzentration kann die Inkubationszeit verkürzt werden.

8. Bei niedriger Antigen-Konzentration ergibt sich eine verlängerte Inkubationszeit; u.U. ist eine Inkubation bei 4°C über Nacht zu empfehlen.

9. Bakterielle Kontamination der Lösungen vermeiden!

10. Puffer zum Ansetzen des ABC-Reagenzes und der Substrate dürfen keine Konservierungsmittel und keine Proteine oder Serum enthalten!

11. Für die AP-Substrate ist ein Tris-Puffer (pH 8,5 - 9,5) zu empfehlen, PBS sollte hier vermieden werden!

12. Pufferlösungen in doppelt destilliertem Wasser ansetzen

13. Reagenzien immer bei 2 - 8°C aufbewahren, Antikörper ohne Konservierungsmittel sind portioniert bei -20°C zu lagern.

14. Beachten Sie das Verfallsdatum von Reagenzien. Bei Verwendung der Tropfflaschen und gekühlter Lagerung sind VECTASTAIN ABC Reagenzien min. ein Jahr haltbar.

15. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Primärantikörper ist zu vermeiden. VECTASTAIN ABC Reagenzien werden bei 2 - 8°C gelagert. Tiefgekühlte Lagerung ist nicht vorteilhaft!